创新血浆蛋白质组平台

创新的全自动血浆蛋白富集方案，Biomarker筛选新突破

血浆蛋白质深度探索平台

ProteographTM平台 (Seer)—开启血浆蛋白质组探索新篇章

*血浆蛋白质组、疾病、研究现状*

Plasma Proteome

图1. 血浆—疾病分子标志物（biomarker）筛选、发现、转化和应用的热点样本。

  • 血液是人体的体液库，血液中的血浆组分（Plasma）中包含了来自人体各个组织和器官的信息分子（DNA、RNA、蛋白质和代谢物等），通过血液循环实现远距离的信息传递和调控。血浆信息分子中，蛋白质的种类（>1万种）和复杂度（cSNP（单氨基酸改变）、isoform（可变剪接体编码产物）、PTM（翻译后修饰））远超其它分子类型。因为蛋白质是生命体的功能分子和执行者，血浆蛋白质组（Plasma Proteome）的动态变化直接指针人体生理和病理的变化；此外，血浆组分稳定，易于获取，对患者的创伤小等诸多优点，使得从血浆中筛选与人体生理和病理相关联的蛋白质分子标志物（Biomarker）成为长久以来的研究热点。

  • 质谱（MS, mass spectrometry）作为高通量驱动的发现型技术平台，广泛应用于病理/生理相关的血浆蛋白质分子标志物的发现和筛选。然而，由于血浆蛋白质组（Plasma Proteome）的复杂性和独特性，现有的MS技术对血浆蛋白质组的解析度非常有限，血浆蛋白质标志物的发现和应用进展极为缓慢，血浆蛋白质组研究面临巨大挑战，亟待出现新的技术方案。

*ProteographTM创新技术平台诞生*

Proteograph_1

图2. ProteographTM技术原创及产品套件。

  • 图A. 2020年，美国Seer公司（https://seer.bio/）在Nature Communications上发文，创新型地开发并使用了5种、带有不同表面修饰的纳米磁珠（nanoparticle, NP）完成了对141个血浆样本（80个健康对照，61个非小细胞肺癌）的快速、高深度和规模化分析。（1）共鉴定到了2499种血浆蛋白，实现了对血浆蛋白质组研究宽度（Width，指蛋白质鉴定的数目）的大幅提升；（2）鉴定到的蛋白质动态分布范围（dynamic range）跨越8-9个数量级（比传统技术提升~4个数量级），实现了对血浆蛋白质组深度（Depth，指鉴定到的血浆蛋白质浓度差异倍数）探索的常态化突破；（3）其中2066种蛋白匹配到HPPP (Human Plasma Proteome Project) 数据库中；（4）其中1276种蛋白质浓度是低于10ng/ml 的血浆低丰度蛋白；（5）仅用2周左右的时间完成了141个样本从血浆开始到质谱检测的全部实验，实现了规模化的高通量分析；（6）发现了多个新的、与非小细胞肺癌（NSCLC）相关联的血浆蛋白质分子标志物。

  • 图B. 基于文献的创新技术，Seer推出了自动化的血浆蛋白质组高深度覆盖解决方案——ProteographTM产品套件平台。该平台包含（1）ProteographTM Assay kit：5种NP磁珠和全套配套试剂耗材，可同时平行处理16个样本；（2）SP100全自动化工作站；（3）PAS (ProteographTM Analysis Suite) 高度集成的质谱数据分析统计软件。

*ProteographTM技术平台的本地化表现力*


图3. Seer的SP100 (ProteographTM) 自动工作站。


Proteograph_2

图4. ProteographTM技术平台对血浆蛋白质组分析的表现力。

  • 图A. 利用ProteographTM平台结合质谱对2组共16个血浆样本进行了分析，共鉴定到3540种血浆蛋白，两组共同鉴定到的蛋白质为3259种。

  • 图B. 在血浆蛋白质组探索深度（depth）上，Proteograph平台对传统技术的比较。TMT-6plex共鉴定到498种蛋白质（详见图6），其中浓度低于10ng/ml（与HPPP数据库比对）的蛋白质仅鉴定到22种；而在Proteograph鉴定到的3504种蛋白质中，浓度低于10ng/ml的蛋白质有1683种，是TMT-6plex的76.5倍！


ProteographTM

TMT (Tandem Mass Tag, 下述图6)

样本前处理方式自动手动
血浆高丰度蛋白去除步骤否是
样本数量
16
6
样本前处理时间（小时）（从血浆到肽段）
772~96
馏分分离数目（Fraction）8015
质谱检测时间（小时）~6030
蛋白质鉴定总数目
3504
498
< 10ng/ml的蛋白质鉴定数目1683
22
检测深度8~9 log
4-5 log

表1. ProteographTM与TMT（传统技术）比较表。

*扩展阅读*


幻灯片1

图5. 人血浆蛋白质组的特征。

  1. 血浆/血清中的蛋白质种类超过上万种，白蛋白（ALB）及其他20 种高丰度蛋白占据了血清/血浆总蛋白的99%。

  2. 血浆/血清蛋白质组的动态分布范围（dynamic range）跨越10~12个数量级（10~12 log）。比如ALB（白蛋白）的浓度约为50mg/ml，而细胞因子如IL6的浓度仅为5pg/ml，二者浓度相差1010倍 （10 log）。

  3. 在血浆/血清中，筛选和发现与疾病相关的分子标志物（Biomarker）是长期以来的研究热点。然而，由于血浆/血清蛋白质组的超高动态分布范围，目前的蛋白质组学技术（iTRAQ/TMT、label-free、DIA/SWATH、DIA-PASEF等）仅能从血浆/血清中鉴定出几百种蛋白质，并且几乎都是高丰度（high abundant proteins）。

  4. 血浆/血清是研究的热点，又是长期以来的研究“痛点”。不能实现高深度覆盖，“看不到”更多、更低丰度的蛋白，蛋白质biomarker的筛选、发现和转化应用都无从谈起。


幻灯片2

图6. 基于TMT传统技术对血浆蛋白质组的分析表现（自研数据）。

  • TMT血浆蛋白质组分析流程（图A）：

  1. 利用TMT-6plex试剂盒（TMT: Tandem Mass Tag, ThermoFisher Scientific) 对6个血浆样本进行蛋白质组分析（图A）。

  2. 6个血浆样本分别进行（1）高丰度去除（depletion），（2）去除高丰度蛋白的样品trypsin酶解，（3）酶解肽段TMT-6plex标记，（4）TMT标记肽段馏分分离（fractionation），共分为15个fraction。

  3. 对15个fraction分别进行质谱鉴定，2h/fraction，共计30小时质谱测试时间。

  4. 最终仅鉴定/定量了498个血浆蛋白。

  • TMT鉴定的血浆蛋白质覆盖深度分析（图B）：

  1. 对鉴定到的498个蛋白，与HPPP血浆蛋白质组数据库进行比。

  2. 鉴定到的蛋白质几乎都是10ng/ml以上的蛋白质，浓度低于10ng/ml的蛋白仅有22个。

  3. 蛋白质的鉴定深度（depth）仅有4-5 log（血浆蛋白质组的动态分布范围为10-12 log）。

  • 参考文献：

  1. Nature communications 2020, 11(1):3662.

  2. Proceedings of the National Academy of Sciences 2022,119(11):e2106053119.

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